全基因庫篩選/功能基因組學
2019.08.19
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1. CRISPR/cas9文庫簡介

? ? ? ? ??2013年以來,CRISPR/cas9技術憑借著成本低廉,操作方便,效率高等優點,已迅速風靡全球的實驗室,成為了生物科研的有力幫手,是繼“鋅指核酸內切酶(ZFN)”、“類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)”之后出現得第三代“基因組定點編輯技術”。

? ? ? ? ?CRISPR/cas9系統最初在大腸桿菌基因組中被發現,是細菌中抵抗外援病毒得免疫系統。CRISPR/cas9系統由兩部分組成,一部分是用來識別靶基因組得,長度為20bp左右得sgRNA序列,另外一部分是存在于CRISPR位點附近得雙鏈DNA核酸酶-Cas9,能在sgRNA得引導下對靶基因進行切割,最終通過細胞內得非同源性末端連接機制(NHEJ)和同源重組修復機制(HDR)對形成斷裂的DNA進行修復,從而形成基因的敲除和插入,最終實現基因的(定向)編輯。

? ? ?與前兩代技術相比,CRISPR-Cas9技術最大的突破是不僅可以對單個基因進行編輯,更重要的是可以同時對多個基因進行編輯,這也為全基因組篩選提供了有效的方法。

2.?CRISPR/cas9文庫種類

1)CRISPR/cas9敲除文庫:


表格1.jpg?


2)CRISPR/cas9激活文庫:


表格2 (2).jpg

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3)人源lncRNA激活庫


表格3 (2).jpg



4) 定制CRISPR/cas9文庫

靶位點確認及sgRNA文庫設計;

sgRNA文庫芯片合成;

sgRNA文庫構建;

QC驗證文庫質量。


3. CRISPR/cas9文庫篩選流程


圖1.png


4.?CRISPR/cas9文庫應用實例

1)陽性選擇,通過隨機誘變收集具有生長優勢的群體。


?圖2.png

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2)陰性選擇,確定特定條件下生存的必須基因,如果一個細胞攜帶了靶向生存必須基因的gRNA,那么敲除后的細胞不能存活。



圖3.png



3)案例展示

1.?Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis



圖4.jpg

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采用“全基因組CRISPR敲除文庫”,經過慢病毒庫擴增后,病毒庫感染肺癌細胞株,經篩選后接種到裸鼠皮下,定期觀察直至其肺部生成足量轉移灶,取肺組織并提取基因組DNA,通過PCR技術擴增sgRNA靶序列,高通量測序獲得轉移靶基因。

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2.?A genome-scale CRISPR-Cas9 screening in myeloma cells identifies regulators of immunomodulatory drug sensitivity


圖5.jpg



? ? 利用CRISPR-Cas9技術,在多發性骨髓瘤細胞中進行了全基因組篩選,尋找能夠進一步提高免疫調控類藥物療效的潛在靶點。該文章使用的GeCKOv2文庫能針對細胞內的19050條基因(每條基因被6條sgRNA所靶向)和1864條微RNA(每條微RNA被4條sgRNA所靶向),這能確保篩選的覆蓋率。通過如下篩選流程:CRISPR-Cas9文庫擴增--感染MM1S細胞--使用泊馬度胺進行藥物篩選--收取藥物篩選7d,14d,21d的實驗組及對照組細胞進行高通量測序。發現多發性骨髓瘤對亞胺類藥物產生耐藥的機制,并針對多發性骨髓瘤對提出了新的治療方案,以增強對亞胺類藥物的敏感性或克服耐藥性。



3.Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in gastrointestinal stromal tumor?with Imatinib resistance



圖6.jpg






? ? ?? ??伊馬替尼(格列衛)是一種治療白血病及胃腸道間質腫瘤的藥物,但往往產生耐藥,機制不明。在該研究中,研究人員利用CRISPR-Cas9全基因敲除文庫技術篩選針對胃間質瘤的伊馬替尼耐藥的基因。


5.?CRISPR/cas9文庫應用拓展,與新藥篩選,整體課題進行鏈接

新藥篩選:基因與藥物

整體課題:腫瘤相關基因經典研究方案


6.?參考文獻

1)Chen S, Sanjana NE, Zheng K, et al.Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis.Cell. 2015 Mar 12;160(6):1246-60.

2)Liu J, Song T, Zhou W, et al.A genome-scale CRISPR-Cas9 screening in myeloma cells identifies regulators of immunomodulatory drug sensitivity.Leukemia. 2019 Jan;33(1):171-180.

3)Cao J, Wei J, Yang P, et al.Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in gastrointestinal stromal tumor with Imatinib resistance.Mol Cancer. 2018 Aug 13;17(1):121.?


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