外泌體研究整體方案
2019.05.09
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? ? ? ?2013年諾貝爾生理學或醫學獎授予美國科學家詹姆斯?羅思曼、蘭迪?謝克曼以及德國科學家托馬斯?祖德霍夫,以表彰他們發現細胞的囊泡運輸調控機制。這使得外泌體相關研究成為學術界的大熱門,大批科研工作者投入到研究外泌體研究的熱潮中。


1. 外泌體簡介

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? ? ? 外泌體(Exosome)是一種直徑為30-100nm的納米級脂質包裹體結構,廣泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等多種體液中。其內部包裹了蛋白、mRNA、miRNA和少量DNA等物質,這些生物活性物質可在細胞之間穿梭并介導細胞間的物質轉運與信息交流,進而影響細胞的生理功能。部分腫瘤中的研究發現,有些miRNA會通過外泌體到達其他細胞組織,調控腫瘤侵襲、轉移、耐藥、微環境等。


2. 服務內容

? ? ? ?1)外泌體分離提取,包括血清、細胞培養上清、尿液等

? ? ? ?2)外泌體鑒定,包括透射電鏡、流式細胞術、Western blot、納米顆粒示蹤等

? ? ? ?3)外泌體基因、蛋白檢測分析技術(mRNA、miRNA、lncRNA、protein等)

? ? ? ?4)細胞功能以及動物實驗驗證外泌體的功能

? ? ? ?5)結合miRNA、lncRNA、功能蛋白等的研究方法檢測外泌體的生物學功能以及作用機制

3. 外泌體提取

? ? ? ?外泌體的提取有試劑盒法,超速離心法,超濾法,三種方法都可提取血清、血漿和細胞培養上清的中的exosome,但不同的樣本、不同實驗需求,需要做適當調整。

? ? ? ?血清:若只用于芯片檢測,推薦超速離心法,需樣本0.5-1ml;若除了芯片檢測,還需用于其它實驗,推薦試劑盒法,需樣本0.5-1ml;凍存樣本為血清。

? ? ? ?血漿:若只用于芯片檢測,推薦超速離心法,需樣本0.5-1ml;若除了芯片檢測,還需用于其它實驗,推薦試劑盒法,需樣本0.5-1ml;凍存樣本為血清。

? ? ? ?細胞上清(FBS):推薦超濾法,需培養上清150-200ml。

? ? ? ?細胞上清(FBS-free):推薦試劑盒提法,需培養上清50-80ml。

? ? ? ?細胞上清(exosome-free FBS):推薦試劑盒提法,需培養上清50-80ml。

4. 外泌體鑒定

? ? ? ?透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope)及納米顆粒示蹤分析(Nanoparticle Tracking Analysis)確證大小,免疫印跡(Western blot)驗證標記蛋白CD9/CD63/CD81/HSP70。

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5. 案例展示

? ? ? ?Title:Exosomal miR-1290 and miR-375 as prognostic markers in castration-resistant prostate cancer

? ? ? ?Journal:EUR UROL

? ? ? ?Impact factor:17.298

? ? ? ?目的是研究外泌體中的miRNA能否對前列腺癌患者的預后情況進行評估,首先通過對多個前列腺患者的血漿外泌體進行高通量測序,分析得到miR-375和miR1290有顯著的差異表達,并與前列腺癌預后有顯著關聯。然后通過QPCR的方法對高通量測序結果進行驗證。為前列腺癌的診斷標志物研究提供新的論據。

技術路線

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結果展示

? ? ? 1. 通過外泌體高通量測序數據分析發現已知的microRNA 375個,未知的microRNA 57個;選擇穩定表達的micorRNA-30a-5p和micorRNA-30e-5p作為定量PCR檢測驗證的內參。

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外泌體RNA種類及含量分布圖

2. 高通量測序分析出差異表達基因中,通過QPCR方法驗證得到生存相關性的三個microRNA(microRNA-1290、microRNA-1268和microRNA-375)。其中microRNA-1290和microRNA-375與前列腺病人生存周期相關。通過臨床預后模型分析miR-1290和miR375,發現這兩個血漿外泌體的microRNA可作為去勢抵抗性前列腺癌病人有效預后監測的分子標記物。

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Kaplan-Meier存活函數法預后分析


參考文獻

Huang X, Yuan T,et al. Exosomal miR-1290 and miR-375 as prognostic markers in castration-resistant prostate cancer.Eur Urol. 2015 Jan;67(1):33-41.


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