miRNA研究整體方案
2019.05.09
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miRNA研究思路

一.技術路線

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二.研究內容

第一步 確定差異miRNA表達

? ? ? ? 利用 RT-PCR 或者 RT-qPCR 檢測 miRNA 在不同細胞或者組織中的表達水平。

第二步miRNA的功能研究

? ? ? ?探討miRNA功能可用 gain/loss of function 策略,過表達或沉默 lncRNA 后觀察表型。即研究 lncRNA 功能獲得后或者功能缺失后對細胞增殖、凋亡、侵襲、轉移與克隆形成,以及病毒的轉錄復制等的影響。

? ? ? (1)功能獲得性研究

構建 miRNA 過表達質?;蛘呗《?、腺病毒包裝載體。原則上是將全長miRNA 定向克隆到表達載體上實現miRNA 的過表達。

? ? ? (2)功能缺失性研究

可用 siRNA、shRNA、反義核酸、CRISPR/Cas9 等方法沉默 lncRNA,經 qRT-PCR 或 FISH 等驗證后觀察其對疾病相關基因表達和對細胞表型等的影響。

第三步 miRNA靶基因的預測

? ? ? ?通過miRBase, targetscan,starbase等在線網站預測可以與miRNA結合的靶基因,并通過間接實驗和直接實驗進行驗證。

? ? ? (1)間接實驗:通過WB或qPCR的方法檢測miRNA過表達或抑制細胞株中靶基因的表達水平

? ? ? (2)直接實驗:

? ? ? ?a. 雙熒光素酶實驗:

? ? ? ?b. EMSA

? ? ? ?c. CHIP

第四步 挽救實驗

? ? ? ?假如miRNA對靶基因的調控是經典的負調控關系,miRNA過表達后會對細胞的某些功能表型產生影響,那么挽救實驗就是將靶基因再過表達后看下這些功能表型能否逆轉。

第五步 機制研究

? ? ? ?miRNA的作用機制類型很多,除經典的靶向負調控靶基因外,還有以下7種類型,需根據不同的機制選擇不同的研究方法進行研究。

? ? ?(1)miRNA的前體pri-miRNA可翻譯為多肽

? ? ?(2)miRNA可與其他功能蛋白相結合

? ? ?(3)miRNA可直接激活TLR受體蛋白(非改變表達量)

? ? ?(4)miRNA可提高蛋白表達水平

? ? ?(5)miRNA靶向調控線粒體相關基因mRNA

? ? ?(6)miRNA可直接激活基因轉錄過程

? ? ?(7)miRNA可靶向負調控其他非編碼RNA的前體RNA

第六步 體內驗證

? ? ? 有條件的實驗室可以繼續通過動物實驗,在體內或者臨床樣本水平進行驗證。

參考文獻:

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