JEV:神經母細胞瘤分泌攜帶miR-375的外泌體促進骨髓間充質基質細胞的成骨分化
2020.10.20
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近期,意大利的耶穌圣嬰兒童醫院的Angela Di Giannatale團隊研究發現神經母細胞瘤來源外泌體攜帶miR-375,遠端轉移到骨髓創造有利的環境,從而促進骨轉移,該研究結果發表于Journal of Extracellular Vesicles 。


01??案例文章


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骨髓是神經母細胞瘤(neuroblastoma ,NB)轉移的靶器官,NB侵襲骨髓的機制仍然是未知的。腫瘤微環境在腫瘤發生發展中扮演著重要作用,間充質基質細胞被認為是腫瘤間質的組成部分。與NB患者(無骨髓轉移)相比,骨髓轉移NB患者的骨髓間充質基質細胞(BM-MSCs)展現出較強的成骨分化潛能。骨髓轉移的的NB細胞分泌的外泌體高表達miR-375,促進BM-MSCs成骨分化。臨床數據顯示,miR-375高表達與NB患者骨髓轉移相關。結果表明,外泌體miR-375在骨髓創造一個有利的微環境從而促進腫瘤轉移。miR-375作為一個新的生物標志物,也是NB患者發生骨髓轉移的潛在靶標。


02??案例文章的研究內容


? NB 和 BM 轉移患者的BM-MSCs 有較強的成骨分化潛力

分別從12個NB患者(8個骨轉移,MBM-MSCs;4個無骨轉移,NMBM-MSCs)和7個健康人(HC-MSCs)分離MSCs。流式分別檢測MSCs標志物(CD90,CD105, CD81, CD9 )和NB細胞表面標志物(GD2)均為陽性;造血干細胞標志物(CD34, CD45 )和神經元標志物(CD56),為陰性。原代分離的3組MSCs群體倍增時間無差異。成骨分化和qPCR檢測成骨分化相關因子(RUNX2, OSTERIX,BMP2,SPP1),MBM-MSCs 有較強的成骨分化潛能。


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? BM轉移的NB細胞來源外泌體增強HC-MSCs的成骨分化

分別從原代腫瘤細胞(IMR-32 and IGR-NB8 cells )和BM轉移的NB細胞(SKNSH, SHSY5Y, SKNBe2 c,LAN-1 and IGR-N91 )分離外泌體。IMR32 exo和SHSY5Y-derived exo分別與HC-MSCs共培養24h,共聚焦成像、qPCR檢測、WB檢測和成骨誘導表明,與IMR32 exo 組(原位腫瘤細胞)相比,SHSY5Y-derived exo組(骨轉移來源腫瘤細胞)MSCs內化的外泌體、骨分化相關因子(RUNX2, OSTERIX,BMP2,SPP1)和鈣沉積被顯著提高;


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? miR-375在BM-metastasisNB細胞來源的外泌體和MBM-MSCs中高表達

RT-qPCR分別檢測7個NB細胞(IMR-32,IGR-NB8 cells,SKNSH, SHSY5Y, SKNBe2 c,LAN-1,IGR-N91 )來源的外泌體miRNA表達。與原代腫瘤細胞來源外泌體相比,骨轉移NB細胞來源外泌體中,miR-375, miR-365a-3p, miR-193b-3p, miR-18a-3p, miR-140-5p 表達上調;另外,在MBM-MSCs 或SHSY5Y-exosomes /HC-MSCs 共培養模型中,miR-375也顯著上調。


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靶標預測顯示,YAP1 和DEPTOR 可能是miR-375 的潛在靶點,YAP1參與Hippo 信號通路,抑制RUNX2的活性(成骨細胞成熟必須的因子)。因此,作者推測NB分泌的外泌體攜帶miR-375到骨髓通過抑制YAP1促進成骨分化。在骨轉移來源的NB 細胞中,YAP1 的mRNA和蛋白水平顯著低于原位腫瘤細胞;不同腫瘤細胞來源的外泌體與HC-MSCs共培養,SH5YSY-derived exosomes 組YAP1和DEPTOR 的mRNA、蛋白水平顯著降低。在MBM, NMBM- 和HCMSCs ,YAP1 的mRNA和蛋白表達在MBM-MSCs中也顯著降低。


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? MiR-375調控成骨轉化因子的表達

分別構建了MiR-375過表達NMBM-MSC細胞,及MiR-375下調MBM-MSC 細胞。RT-qPCR結果表明,MiR-375過表達顯著下調YAP1的mRNA和蛋白水平,然而成骨標志物SPP1 and OSTERIX 顯著上調。相反的,抑制miR-375可以上調YAP1和DEPTOR 的mRNA和蛋白表達。


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? MiR-375表達與NB患者的骨疾病相關?

為了探索MiR-375與NB患者骨髓浸潤的相關性,17個HC,7個NMBM 患者和14個MBM患者的外周血來源的外泌體被收集,Q-PCR 分別檢測患者及患者血清來源的外泌體,在MBM組,MiR-375的表達上調。隨后27個NMBM和33個MBM患者的骨髓樣本被收集, 突觸素(觀察NB細胞的侵襲)、miR-375 表達水平被評估;miR-375 不僅在NB細胞中表達也在成骨及骨髓的其他細胞中表達。miR-375 在NB患者的臨床相關性分析顯示,miR-375陽性與NB患者發生骨轉移正相關。在SCID小鼠模型中,PKH26 標記的外泌體可以轉移到骨髓,并且外泌體注射組miR-375表達顯著升高。


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總之,本研究闡明了神經母細胞瘤通過外泌體中的miR-375,促進骨髓間充質基質細胞的成骨分化。



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